Apoptoza w miocytach w niewydolności serca w stadium końcowym czesc 4

W panelu D występuje ogniskowe rozmieszczenie komórek apoptotycznych w centrum zawału, zidentyfikowane przez ich brązowe jądra (groty strzałek) (końcowe znakowanie dla komórek apoptotycznych i barwnikowanie hematoksyliną x × 200). Na obrzeżach zawału (Panel E) komórki apoptotyczne z niebieskoszarymi jądrami (groty strzałek) są mieszane z żywymi miocytami (komórkami [brązowymi] aktynowymi w lewym górnym rogu) i komórkami nekrotycznymi. W panelu F obszary miokardium z dala od strefy zawału zawierają pozytywne dla aktyny komórki nieapoptotyczne na podwójnym barwieniu. (Panele E i F, znakowanie końcowe dla komórek apoptotycznych i barwienie immunoperoksydazą dla aktyny, × 200). Skrawki tkanki utrwalone formalnie, z prostaty od wykastrowanych szczurów, zostały użyte jako kontrole pozytywne.23 W przypadku ewokowania szczurzego prostaty apoptozę rozpoznano w nabłonkowej wyściółce gruczołu krokowego (ryc. 1A). Frakcja komórek apoptotycznych zidentyfikowanych przez etykietowanie końcowe i liczba zidentyfikowana na podstawie kryteriów morfologicznych były podobne. Próbki mięśnia sercowego od czterech osób, które zginęły w wypadkach samochodowych, zostały wykorzystane jako kontrole ujemne. Te próbki mięśnia sercowego wykazały rzadkie, wyizolowane komórki z fragmentacją DNA (Figura 1B i Figura 1C); naczynia krwionośne i komórki śródmiąższowe w mięśniu sercowym były prawidłowe.
Wykazano, że próbki tkanek mięśnia sercowego uzyskane od pacjentów z ostrym zawałem mięśnia sercowego zawierają duże populacje komórek apoptotycznych24; w związku z tym wykorzystaliśmy cztery takie próbki jako kontrole pozytywne do znakowania końcowego na miejscu. Komórki apoptotyczne w tych próbkach obserwowano w centralnym obszarze martwicy (Figura 1D) i rzadko w strefach granicznych zawałów (Figura 1E). Normalne miokardium daleko od miejsca zawału nie wykazywało dowodu fragmentacji DNA (Figura 1F).
Izolacja genomowego DNA, końcowego znakowania i elektroforezy
Zamrożone próbki tkanki serca rozdrobniono i homogenizowano w buforze do ekstrakcji (100 mM chlorek sodu, 10 mM chlorowodorek TRIS, pH 8,0, 25 mM EDTA, 0,5 procentowy dodecylosiarczan sodu i 0,1 mg proteinazy na mililitr) i inkubowano w 50 ° C C przez noc. Lizaty tkankowe ekstrahowano dwukrotnie fenolem-chloroformem (1: 1). Do warstwy wodnej dodano 0,2 ml octanu sodu i 5 ml etanolu. DNA nawijano z roztworu i przemyto raz 70% etanolem, krótko wysuszono na powietrzu i ponownie zawieszono w 100 .l wody destylowanej. W celu uniknięcia możliwości utraty małych fragmentów DNA podczas nawijania DNA, całkowity osad DNA zebrano w innym zestawie doświadczeń przez odwirowanie przy 10 000 obrotów na minutę przez 15 minut. Ponadto, roztwór pozostawiony po nawinięciu DNA trzymano w -20 ° C przez jedną godzinę i odwirowywano jak opisano powyżej. Osad wysuszono na powietrzu i ponownie zawieszono w 50 .l wody destylowanej. Supernatant liofilizowano w próżni, a następnie ponownie zawieszono w 50 .l wody destylowanej.
Badaliśmy fragmentację nukleosomów za pomocą metody znakowania końcowego.21 Krótko, .g genomowego DNA znakowano końcowo w 30 .l buforu reakcyjnego (10 mM chlorowodorek TRIS, pH 7,5, 5 mM chlorek magnezu i 5 U polimerazy Escherichia coli I / Klenow, New England Biolabs, Beverly, MA) z 0,5 .C [3P] a-deoksycytynozy-trifosforanu (3000 Ci na milimol; New England Nuclear-Dupont, Boston) w temperaturze pokojowej przez 30 minut
[więcej w: agaricus, suprasorb, oprogramowanie stomatologiczne ]
[podobne: melanoza, miopatia objawy, raloksyfen ]