Dowód apoptozy w arytmogennej dysplazji komór komorowych ad

Żaden z tych pacjentów kontrolnych nie spełniał żadnego histologicznego kryterium dla dysplazji prawej komory. Chociaż przerwa między śmiercią a autopsją nie miała wpływu na wykrycie apoptozy, uwzględniono tylko przypadki, w których odstęp ten wynosił 24 godziny lub mniej. Tkanki utrwalono w 10% zbuforowanej formalinie i zatopiono w parafinie. Cztery do sześciu odcinków (o grubości 6 .m) z każdego bloku parafiny analizowano na obecność apoptozy.13 Wykrywanie obecności komórek apoptotycznych w teście
Skrawki poddano deparafinizacji, przeniesiono do ksylenu i ponownie uwodniono w malejących stężeniach alkoholu (100%, 95%, 70%, 50% i 0%). Po rehydratacji, szkiełka inkubowano z 20 .g proteinazy K na mililitr w soli fizjologicznej buforowanej fosforanem. Endogenna peroksydaza była inaktywowana przez 3% nadtlenek wodoru. Skrawki tkanki barwiono za pomocą układu ApopDETEK (Enzo Diagnostics, Farmingdale, NY), który identyfikuje komórki z internukleosomalną fragmentacją DNA (apoptoza). Procedurę przeprowadzono zgodnie z instrukcjami producenta. Metoda opiera się na preferencyjnym wiązaniu końcowej deoksyrybonukleotydylotransferazy (TdT) z końcami 3 -hydroksylowymi DNA.13 Krótko, reszty biotynylowanego trifosforanu deoksyurydyny (dUTP) zostały katalitycznie dodane do końców fragmentów DNA enzymem TdT. W przypadku kontroli negatywnej zamiast TdT użyto wody dejonizowanej. Po znakowaniu końcowym skrawki inkubowano z peroksydazą chrzanowo-awidynową i barwiono diaminobenzydyną w celu wykrycia jąder znakowanych biotyną. Ciała apoptotyczne zabarwione na brązowo. Pozytywne kontrole obejmowały szczurzą gruczoły sutkowe uzyskane w czwartym dniu po odsadzeniu (Oncor, Gaithersburg, MD). Badano cztery do sześciu przekrojów z każdego okazu. Skrawki badano najpierw pod mikroskopem świetlnym przy małym powiększeniu (x 100), pozwalając oszacować procent powierzchni zajmowanej przez komórki apoptotyczne. Następnie, 10 losowych pól na sekcję z regionów z komórkami apoptotycznymi badano przy większym powiększeniu (x 400), aby obliczyć procent jądra mięśnia sercowego z fragmentacją DNA. Cardiomyocyty, które miały dobrze ukształtowane, wydłużone i prążkowane komórki, można było łatwo odróżnić morfologicznie od innych rzadkich nie-miocytów pod mikroskopem świetlnym przy dużym powiększeniu. Oprócz techniki znakowania końcowego in situ, sąsiednie sekcje barwione hematoksyliną i eozyną badano pod kątem oznak apoptozy.14 Patolog analizujący próbki był nieświadomy diagnozy w 9 z 12 zbadanych przypadków.
Immunohistochemiczne wykrywanie proteazy CPP-32
CPP-32 jest proteazą cysteinową wymaganą do rozpoczęcia apoptotycznej śmierci komórek.15 Jest związany z enzymem konwertującym interleukinę-1. (ICE) i CED-3, produktem genu wymaganym do zaprogramowanej śmierci komórki w nicieniu Caenorhabditis elegans . CPP-32 jest specyficzną dla ICE / CED-3 podobną ssaczą proteazą cysteinową, która rozszczepia i dezaktywuje polimerazę poli (adenozyno-difosforanową rybozę), enzym zaangażowany w naprawę DNA i integralność genomu, a zatem może być ludzkim odpowiednikiem CED-3,15. , aby dostarczyć dalszych dowodów na występowanie apoptozy w arytmogennej dysplazji prawej komory, przeanalizowaliśmy poziom ekspresji CPP-32 w prawej komorze pacjentów i kontroli za pomocą technik immunohistochemicznych.
Po deparafinizacji i rehydratacji skrawki inkubowano z normalną surowicą końską 1:10 przez 30 minut w temperaturze pokojowej, przemyto raz w soli fizjologicznej buforowanej fosforanem i wybarwiono mysim monoklonalnym przeciwciałem anty-CPP-32 (Transduction Laboratories, Lexington, Ky .) przy rozcieńczeniu 1: 1000
[przypisy: chloramfenikol, suprasorb, anakinra ]
[przypisy: neuralgia międzyżebrowa leczenie, psychopraca, odleżyny na piętach ]