Ekstrakcja RNA i PCR w czasie rzeczywistym

width=300Przygotowano lizaty białka z kontrolnych i zmutowanych jąder (myszy) lub z limfocytów krwi obwodowej (PBL) (człowieka). Całkowitą zawartość białka oznaczono metodą Bradforda. Każdą próbkę poddano SDS-PAGE a membranę poddano immunoblottingu za pomocą króliczego przeciwciała XRCC2 (GeneTex, GTX16397) w rozcieńczeniu 1: 1000. Wtórne przeciwciało IgG-HRP (1: 2000, Santa Cruz Biotechnology) i zestaw do chemiluminescencji ECL (GE Healthcare) zastosowano do wizualizacji sygnału.

Całkowity RNA ekstrahowano z tkanek testowych (myszy) lub z PBL (człowieka) przy użyciu zestawu RNAiso Plus (TaKaRa, Dalian, Chiny). cDNA zsyntetyzowano z 1 ug RNA przy użyciu zestawu do syntezy cDNA pierwszej nici PrimeScript II (TaKaRa, Dalian, Chiny). Reakcje PCR przeprowadzono na systemie PCR 7500 w czasie rzeczywistym (Applied Biosystems) przy użyciu NovoStart SYBR qPCR SuperMix (Novoprotein, Shanghai, China). Startery wykorzystano w doświadczeniach qPCR: XRCC2-5UTR-F i XRCC2-3UTR-R. Każde oznaczenie zostało zduplikowane cztery razy. Dane analizowano za pomocą niesparowanych dwustronnych testów t przy użyciu oprogramowania R.